固相萃取 (SPE) 的基本原理

  如果无需任何样品制备就能准确无误地分析每个样品,那将是非常理想的。不幸的是,通常情况并非如此。通常,可能含有或不含有所研究分析物的基质会干扰定性和定量分析。此外,当面对特别复杂的基质和/或极低浓度的分析物时,稀释不再是一种选择,需要更积极的样品制备步骤。
 
  有许多可能的样品制备选择,但最突出的技术之一是“固相萃取”或固相萃取。如果您需要从样品中分离基质成分以无干扰地监测分析物,固相萃取可能是一种有用的技术。固相萃取可以看作是没有仪器或色谱的液相色谱,因为它采用的原理与分析液相或气相色谱中影响分离的原理相同。
 
  与分析色谱中不同的流动相和固定相类似,固相萃取产品和过程有许多不同的选择。这是个好消息,因为还没有人找到适合所有应用的样品制备程序。在发现它们之前,有适合各种测试场景的选项是一件好事。对于一些分析师来说,固相萃取方法的开发可能不是必需的,因为有许多方法特定的固相萃取产品可用。但是,对于真正需要开发固相萃取方法的分析师来说,大量的选择可能会令人困惑,尤其是对于那些不熟悉固相萃取的人来说。
 
  本文深入讨论了如何为您的样品和分析目标选择最佳固相萃取。它涵盖了固相萃取的基本原理、主要分离机制、典型目标和策略、形式和特点、方法发展和交叉引用。由于没有一套步骤适合所有情况,本文旨在向您介绍一系列固相萃取产品,其说明包含详细的步骤说明。
 
  固相萃取——无声色谱
 
  如果您需要为您的样品确定新的固相萃取方案,因为没有可用的例子或现有的解决方案不足以满足您的分析目标,请记住,固相萃取本质上是另一种色谱形式,尽管它没有好处,这对现代分析色谱中的检测器非常有帮助。因为没有色谱图,所以很容易忘记色谱是在固相萃取柱内进行的,这就是为什么我们经常称固相萃取为“无声色谱”。
 
  固相萃取系统具有流动相,流动相是用于清洁样品而不含污染物或洗脱目标分析物的溶剂。还有一种固定相,固相萃取吸附剂。此外,影响色谱分离的参数也在固相萃取方案中起作用。例如,色谱保留、选择性和效率的理念对于实现分析物和干扰基质成分之间的所需分辨率是必不可少的。
 
  最后,流速对于确保固相萃取能够有效进行分离非常重要。必须有足够的机会与吸附剂相互作用以避免渗透,分析物与不需要的基质成分一起被浪费。与色谱法类似,成功的固相萃取方法所设定的条件会在样品组分与固相萃取系统的流动相和固定相之间产生不同程度的相互作用。了解样品的组成是开发任何固相萃取方法的重要第一步。如果不了解样品的理化特性,很难将样品与SPE吸附剂/溶剂体系进行匹配。
 
  固相萃取的分离机理
 
  了解大多数固相萃取产品中的主要相互作用机制可以帮助您确定样品的重要信息。在大多数固相萃取产品中,有两种主要的相互作用机制:极性和离子交换。固相萃取产品通常依赖于这些机制中的一种或两种,它们可以跨越极性或离子电荷和强度的范围,这取决于您的样品需求。
 
  极地的
 
  当使用极性从基质中分离分析物时,第一个选择是决定哪种模式最好——正常或反向。相对极性的固相萃取吸附剂(例如,裸露的硅胶、氧化铝或弗罗里硅土)和相对非极性的流动相(即正常模式)可以配对,以保留样品的极性成分,同时洗脱非极性成分。或者,将相对非极性的固相萃取吸附剂(例如,具有C18或C8键合相的硅胶)与相对极性的流动相结合将产生相反的效果。这种设置会被视为“反向模式”,因为它与正常模式相反,正常模式最早出现在这种分离的发展中。根据溶剂选择和样品(如卡波姆Plus、二醇),一些吸附剂可以正常或反向模式运行。
 
  固相萃取固定相有许多极性(例如,C18吸附剂的非极性保留比C8大)。此外,流动相溶剂的选择也提供了广泛的极性,这通常可以通过使用溶剂、缓冲液或其他添加剂的混合物来调节。当使用极性差异作为区分分析物和基质干扰(或相互干扰)的关键特征时,可能会有很多技巧。
 
  当极性被视为分离的驱动因素时,“相似性溶解”的格言将会有所帮助。化合物的极性与流动相或固定相越相似,相互作用越强。与固定相的相互作用越强,在固相萃取介质上的保留时间越长。与流动相的强相互作用导致更少的保留和更早的洗脱。
 
  离子交换
 
  如果感兴趣的分析物总是处于带电状态,或者可以根据溶解它们的溶液的条件(如酸碱度)进行充电,那么将它们与基质(或彼此)分离的另一种方法是通过使用能够自行充电的固相萃取介质来吸引它们。
 
  在这种情况下,静电吸引的经典规则适用。不同于依赖极性特征分离和相似溶解的相互作用模型,带电态相互作用遵循“异相吸引”规律。例如,您可能有一个带正表面电荷的固相萃取介质。为了平衡带正电的表面,通常有一种带负电的物质“阴离子”,它最初是与它结合的。如果您的带负电荷的分析物被引入系统,它有能力取代最初结合的阴离子,并与带正电荷的固相萃取表面相互作用。这导致分析物保留在固相萃取相中。这种阴离子交换被称为“阴离子交换”,是更广泛的“离子交换”固相萃取产品类别的一个例子。在本例中,带正电荷的物质将强烈保留在流动相中,不会与带正电荷的固相萃取表面相互作用,因此它们不会被保留。此外,除非固相萃取表面除了离子交换特性外,还有其他特性,否则中性物质至少会保留。但是,这种混合固相萃取产品确实存在,它允许您在同一固相萃取介质中利用离子交换和反相保留机制(例如,聚合物离子交换固相萃取吸附剂)。
 
  使用离子交换机制时需要记住的一个重要区别是分析物电荷状态的性质。如果分析物总是带电的,则无论其溶液的酸碱度如何,它都被视为“强”物质。如果分析物仅在特定的酸碱度下带电,则被视为“弱”物质。了解分析物的这一特性将决定使用哪种类型的固相萃取介质。离子交换固相萃取吸附剂也被定义为“强”或“弱”,考虑将相反的因素放在一起也是有帮助的。建议弱离子交换固相萃取吸附剂与强物质配对,强离子交换吸附剂与弱分析物配对。如果您将强分析物与强吸附剂配对,如果您不使用非常强的酸性或碱性溶液,两者之间的吸引力可能太大而不容易洗脱,这并不总是可取或实用的。将强分析物与强吸附剂配对可能会使它们之间的吸引力太强,以致于在不使用非常强的酸性或碱性溶液的情况下难以洗脱,这并不总是令人满意或实用的。同样,与弱离子交换吸附剂配对的弱物质可能不会显示出足够的保留能力来充分保留分析物并防止渗透。将强分析物与强吸附剂配对可能会使它们之间的吸引力太强,以致于在不使用非常强的酸性或碱性溶液的情况下难以洗脱,这并不总是令人满意或实用的。同样,与弱离子交换吸附剂配对的弱物质可能不会显示出足够的保留能力来充分保留分析物并防止渗透。将强分析物与强吸附剂配对可能会使它们之间的吸引力太强,以致于在不使用非常强的酸性或碱性溶液的情况下难以洗脱,这并不总是令人满意或实用的。同样,与弱离子交换吸附剂配对的弱物质可能不会显示出足够的保留能力来充分保留分析物并防止渗透。
 
  作为离子交换机制作用的一个例子,假设你的样品含有弱酸(pK  a  2-8),你想保留在固相萃取吸附剂上。离子交换保留机制的使用要求分析物和吸附剂都带电。由于弱酸性分析物将与强离子交换吸附剂配对,吸附剂不会成为问题,因为其电荷基本上是永久性的。然而,样品的pH值需要使分析物处于带电状态(pH值与化合物的pK  a相差约两个单位,并且因为我们的例子是弱酸,所以比pK  a高两个单位)。一般来说,酸是一种可以被认为是“放弃热情”并使其带负电的物种。因为你想把带负电荷的分析物(弱酸的“共轭碱”,即阴离子)保留在固相萃取吸附剂上,你需要能吸引阴离子的离子交换产物或“阴离子交换”吸附剂。具体来说,对于本例,建议使用强阴离子交换吸附剂,它可以完全保留带电的分析物,直到洗脱溶剂条件变为足以有效“关闭”分析物的带电状态——在我们的情况下,pH值比分析物的pK  a低约两个单位。此时,中性分析物将不再被离子交换吸附剂保留,并且可以被洗脱。在类似的例子中,如果你的样本包含弱碱,情况正好相反。这是一种可以被认为是“放弃负电荷”的物质,在分析物上留下正电荷(“弱碱性的共轭酸”,即“阳离子”)。强阳离子交换吸附剂将建议并确保样品预处理叶片的分析物处于带电状态(或左右单位低于化合物1的pK值)。
 
  虽然这可能会令人困惑,尤其是对于不熟悉这项技术的人来说,但离子交换吸附剂可能非常有效,尤其是当在上述混合模式中与基于极性的保留机制结合使用时。
 
  未指定的表面相互作用
 
  重要的是要注意可能影响相关吸附剂整体保留性能的额外、非特征性表面相互作用的可能性。当考虑可用作固相萃取吸附剂的不同类型的硅胶时,可以找到这种相互作用的例子,特别是当以反相模式与键合相(例如C18配体)一起使用时。对于C18硅胶,如果硅胶表面有许多可以与样品相互作用的硅烷醇(即Si-OH)基团,吸附剂的整体保留特性可能不仅包括预期的非极性保留C18配体。为此,通常会看到硅胶吸附剂已经或没有被“堵塞”。3)、大大降低了与硅烷醇基强相互作用的可能性。除了暴露的硅烷醇基,二氧化硅颗粒中金属的存在也可能导致非特征性的相互作用,这将使预测保留性能更加困难。
 
  大多数固相萃取供应商努力提供一致和独特的产品,但供应商之间可能存在差异,即使名义上相同的产品也是如此。因此,建议在供应商之间切换时验证性能,在某些情况下,建议在给定供应商的大量材料之间切换时验证性能。
 
  特殊目的实体的目标和战略
 
  在熟悉大多数固相萃取产品的基本机理后,下一步是确定保留什么和洗脱什么。在某种程度上,这一决定将受到固相萃取方法目标的限制。固相萃取通常用于以下一个或多个原因。
 
  净化/清洁
 
  样品纯化或“纯化”是大多数固相萃取方法的主要目标。这些方法优先从可能干扰分析的其他基质成分中分离分析物。目标分析物与干扰和/或污染基质成分的选择性分离会在分析分离前产生显著差异。大多数开发新固相萃取方法的人旨在获得以下好处。
 
  防止基质干扰共流出:
 
  虽然共同外流从来都不理想,但环境会影响其严重性。例如,在气相色谱-火焰离子化检测器或液相色谱-紫外分析的情况下,共流出可能无法定量目标分析物。更糟糕的是,它可能会导致错误识别,因为仪器无法区分干扰峰和目标分析物。甚至连MS和MS/MS用户都会受到负面影响。尽管质谱可能能够区分化合物的光谱和共流出干扰,但这些共流出基质成分仍然抑制或增强目标分析物的电离,导致低或高信号。这种效果可能特别麻烦,因为它可能永远无法直接观察到。只有将代表性和真实空白基质(即不含任何分析物的基质)中精心制备的基质匹配校准标准品的结果与纯溶剂中制备的标准品进行比较,才能直接测定。在很大程度上,需要使用矩阵匹配的校准标准来校正这种影响,
 
  同向流动的基质成分也会导致基线问题。即使基质干扰没有覆盖目标峰,也会出现这种效应。同向流动的矩阵分量会使基线不稳定,从而使有效的自动积分变得困难。不稳定的基线可能需要逐峰手动设置积分参数。这可能会导致额外的时间和精力成本。
 
  充其量,同延矩阵分量是令人讨厌的。在最坏的情况下,它们可能会导致报告结果中出现未检测到的错误。但是,如果它们出现在您的分析中,有一些方法可以解决它们。
 
  如果样品在相对干净的基质中目标分析物相对较少,优化分析分离就足够了。然而,如果矩阵太复杂和/或目标分析物列表太长,优化将不够。当色谱图变得过于拥挤时,需要一种在分析和分离前选择性稀释总体的方法。固相萃取可能会提供答案。
 
  防止与基质干扰发生不必要的相互作用:
 
  虽然一些基质可能会与目标分析物一起洗脱,导致检测过程中出现问题,但其他基质可能根本不会洗脱,而是保留在样品流路中(例如,气相色谱入口、气相色谱或液相色谱柱等)。).在这些情况下,来自先前样品的基质成分可能会引入新的和不需要的机会与目标分析物相互作用。这将导致目标化合物的保留偏移,这将减慢它们在色谱系统中的移动速度,并可能导致峰失真(即峰拖尾)。在某些情况下,这些不需要的成分甚至可能与目标化合物发生反应,引起化学反应,产生一种全新的化合物,而这种化合物从未在样品中出现过。当这种分解发生在分析柱之前时,它将产生新的峰。当分析栏出现故障时,会导致峰值失真。这种矩阵相关的系统污染会威胁到数据质量,所以最好一开始就避免引入。这些影响可以通过稀释样品来减轻,但这也会稀释目标分析物。如果稀释不再是解决方案,固相萃取可能是下一步。
 
  避免矩阵累积导致仪器停机:
 
  随着时间的推移,基质污染物在气相色谱或液相色谱仪器中的积累会导致问题。从短期来看,可以避免目标分析物和基质污染之间不必要的相互作用,但从长期来看,可能会出现需要仪器停机和维护的问题。
 
  在最好的情况下,仪器耗材和硬件在日常预防性维护事件之间表现良好。然而,一批样品在计划的维护之间出现故障并不罕见。在这些情况下,必须进行维护和重新校准,并且必须拆除有工作要做的仪器。
 
  分别
 
  上一节讨论了将目标分析物与潜在干扰或污染基质成分分离的必要性。但是,在其他情况下,在定量分析之前将分析物相互分离可能会有所帮助。
 
  如果样品包含两种不同类别的化合物(例如,可提取石油烃应用中的脂肪族和芳香族化合物(EPH))?每个类可能都需要自己的分析方法。在这种情况下,使用固相萃取有助于粗分离。用固相萃取对样品进行分级,为分析色谱仪的微调分离做准备。
 
  全神贯注
 
  色谱分析人员经常面临试图监测极低浓度目标化合物的挑战。有时,这些浓度远远低于可用仪器的可靠定量极限。在这些情况下,需要一种在分析前浓缩样品的方法。假设有足够的样品可用,定制固相萃取方法可能是一个很好的解决方案,该方法可以强烈保留分析物,但允许洗脱大部分基质。可以收集可检测质量的目标分析物,然后转移到小瓶中,通过洗脱溶剂进行分析。特殊目的实体战略
 
  你可以问“分析物怎么了?这和目标有什么关系?最后,一些物质被固相萃取吸附剂保留,而其他物质被单独洗脱。在这两者之间,建议关注分析物。
 
  如果主要目标是从干扰基质化合物中分离分析物,最直接的安排是使用固相萃取吸附剂,该吸附剂强烈保留基质但不保留分析物,以及用于分析物的强洗脱溶剂。这种“分析物通过”方法允许提取物被固相萃取吸附剂洗脱和收集,因此可以为分析做准备。
 
  然而,由于样品的性质,通过“分析物捕获”实现分析物和基质干扰的最佳分离并不罕见。通过使用对分析物保留能力强(但不太强)的固相萃取吸附剂,可以洗掉基质,并通过切换到强分析物洗脱溶剂来洗脱分析物。如果固相萃取的目的是进行初始分析物分离,这种分析物捕获方法可能是样品分馏所必需的,在分析前浓缩分析物非常重要。
 
  固相萃取格式和特征
 
  建议从了解样品特性、确定样品制备目标、然后选择固相萃取吸附剂和溶剂将目标分析物与干扰物分离的立场出发,发展固相萃取方法。然而,对于固相萃取方法的形式,需要做出一些非常实际的决定。在产品描述中经常会看到几种不同的吸附剂规格,因此了解这些不同的特性如何影响给定产品的性能非常重要。
 
  在格式方面,有几个选项可供选择,其中一些选项比其他选项更常见。
 
  墨盒:固相萃取产品的一种非常常见的形式是小柱,可用于手动或自动系统。它主要由一个柱和一个贮液器组成,柱包含一个或多个填充在筛板之间的吸附床,筛板将吸附床固定到位,贮液器位于吸附床上方,用于添加样品和调节或洗脱溶剂。墨盒有许多不同的尺寸,因此与要提取的样品体积相比,考虑墨盒容器的尺寸非常重要。与固相萃取吸附剂质量相关的储液罐尺寸也很重要,因为它会影响小柱的保留容量。储器的大小能否容纳待分析的样本量?吸附床的尺寸是否允许足够的保留而没有不必要的突破?
 
  96孔板:96孔板的整体格式设计,通常用于高通量实验室常规制备大量样品。整体格式设计类似于一个小栏目。吸附床位于过滤元件之间,上方有一个液体容器,用于保存样品和清洗/洗脱溶剂。不同的是,96个孔中的每一个都像一个单独的墨盒,因此更容易处理大量样本。使用96孔板形式通常意味着不需要小瓶和瓶盖,这很方便,因为96孔板固相萃取产品将适合另一个96孔板收集板。96孔板的选择可能是预先确定的,因为这种格式通常配备从移液器到自动进样器的各种其他特殊设备——。分散固相萃取(d  SPE):作为一种相对快速简单的纯化QuEChERS法收集的提取物的方法,分散固相萃取是一个概念,包括直接向样品提取物中加入固相萃取吸附剂,在分析前简单摇动提取物,然后离心提取物。dSPE产品通常与QuEChERS提取相结合开发,因此它专注于由QuEChERS最初开发支持的食品安全市场。
 
  在线样品制备(ILSP):对于液相色谱-质谱和液相色谱-质谱/质谱应用,样品制备和纯化步骤可以与实际分析相结合,通过添加含有相容吸附剂的小柱来分析液相色谱条件。在这种布置中,样品被注入仪器,并首先通过ILSP柱。分析物与基质的分离在ILSP色谱柱中进行。然后,一旦分析物从ILSP盒洗脱到分析盒(但在基质成分之前),单独的泵和阀装置将切换通过ILSP盒的流动。分析物由分析柱检测,但清洗溶剂将ILSP柱吹回到废液中,为下一次注射做准备。
 
  圆盘:对于一些特定的应用(例如,监测氯化、含联苯胺或含氮农药时饮用水样品的浓度),吸附材料以玻璃或聚四氟乙烯圆盘的形式嵌入。该格式可在方法中指定(例如,美国环保局方法515.2和553)。在清理可能会妨碍墨盒格式的样本时,磁盘格式也很有帮助。此外,由于通过磁盘格式的推荐流速通常比小色谱柱的流速高得多,因此使用固相萃取磁盘可以在更短的时间内清洗大体积样品(如1 L)。
 
  散装:一些固相萃取吸附剂是为喜欢自己制造样品制备设备的客户散装销售的。除非客户有特定的理由购买散装吸附剂,否则这不是典型固相萃取方法开发的常见格式。
 
  除了格式配置,结构材料在与样品的兼容性和固相萃取产品本身不必要干扰的可能性方面也很重要。即使是质量最好的塑料色谱柱也可能无法耐受某些样品,因此可能需要惰性玻璃。此外,尽管由聚四氟乙烯和其他化合物制成的筛板材料通常极其惰性,但如果分析包括对聚或全氟烷基物质(PFAS)的低水平监测,则可能需要另一种选择来避免背景污染。
 
  固相萃取特性描述
 
  在确定要使用的潜在分离机制(极性、离子交换或两者都有)和要尝试的吸附剂后,在产品描述中可能会遇到一些额外的固相萃取特性。这些特性可能会影响方法的性能,因此了解它们为什么如此重要以至于可以出现在产品描述中是有帮助的。
 
  常见规范及其对固相萃取方法性能的影响如下。
 
  吸附剂特性
 
  特点:在给定供应商的产品中遇到不同粒径或孔径/体积的情况并不常见;但是,当比较一个供应商和另一个供应商时,可能会发现差异。如果相关颗粒的孔径大到足以让目标分析物进入,那么在大多数情况下,当考虑以下两个特征时,颗粒与孔径/体积最相关:表面积和碳负载。
 
  注:粒度可以通过直接测量尺寸(例如60微米粒子)或“网目尺寸”来确定。网格尺寸是以网格的线性英寸为单位的开口数量的度量:较大的网格尺寸意味着较小尺寸的开口较多。更高的网孔尺寸相当于更小的颗粒。
 
  表面积(通常以m  2 /g为单位):由颗粒的大小和颗粒孔隙的大小和体积定义,表面积将表明当样品通过时,有多少表面积可用作吸附剂与样品相互作用。表面积越大,保留率越高。与粒径和孔径较大的吸附剂相比,粒径和孔径较小的吸附剂将具有较大的表面积(克对克)。
 
  碳负载量(通常表示为总吸附剂质量的百分比):类似于表面积,与之相关的是碳负载量的概念。一些固相萃取吸附剂具有结合到颗粒表面的化学物质。典型的例子是C18配体结合到硅胶颗粒的表面。由于C18可以保留非极性化合物,原来的正相硅胶颗粒变成了反相SPE吸附剂。在这些情况下,碳负载值是键合配体的表面覆盖率和吸附剂保留率的指标。这个数字最适合作为参考点,据报道,碳负载量较高的吸附剂比碳负载量较低的吸附剂具有更高的保留潜力。
 
  离子交换容量(通常以mEq/g表示):吸附剂的离子交换容量是通过捕获样品中的其他离子来衡量可以使用多少个位点来交换松散结合的抗衡离子。虽然详细讨论常见单位毫当量/克已超出本文范围,但一般来说,数值越大,吸附剂保留样品中带电物质的能力越大。
 
  墨盒特性
 
  保留体积:固相萃取产品的保留体积是洗脱未保留物质所需的溶剂体积。这个概念可以从与分析色谱系统相关的术语中识别出来,如“保留体积/时间”或“死体积/时间”。装载量:固相萃取吸附剂的装载量是对其能保留多少物质的估计,通常约为吸附剂床重的10%。然而,这一估计假设弱溶剂吸附剂可以很好地保留化合物。许多因素会影响最终装载能力(例如,样品的性质、溶剂、流速等)。),因此对于不与吸附剂的主要分离机制相互作用或被非常强的溶剂洗脱的化合物,实际负载量可能低得多。溶剂。如下所述,理解样品/固相萃取方法最可靠的方法是根据经验确定负载能力。
 
  使用随附的固相萃取产品说明作为指南。
 
  鉴于不同类型的样品、分析物和分析之间的巨大差异,没有一种固相萃取方法适合所有人。相反,在了解您的样品并将其与适当的固相萃取产品进行匹配后,产品将有自己的一套说明,可以参考和改进以满足您的特定分析目标。
 
  实验在固相萃取方法发展中的价值
 
  建议在方法开发过程中进行多次实验,以了解所有目标分析物在固相萃取方法所有步骤中的位置。这些实验将有助于在以下方面改进您的分析:
 
  验证吸附剂和溶剂的选择。
 
  确保使用满足方法目标所需的最低固相萃取产品。
 
  确保分析物不会因样品渗透而在装载或清洗步骤中丢失。
 
  确保分析物不会留在吸附剂上,因为它们在选定的条件下无法有效洗脱。
 
  一般要进行的两个实验是“质量平衡”和“突破性”研究,这两个实验都只需要在方法开发过程中进行,以保证过程非常适合相关样品。
 
  质量平衡:这项研究有助于测量分析物在整个固相萃取过程中的移动,包括收集过程中每一步从固相萃取产品中洗脱的所有物质。使用精心准备的非常接近真实样品的样品将确认您是否保留了想要保留的内容,以及您是否在流程的每一步都洗脱了想要洗脱的内容。
 
  突破:本研究使用一系列样品体积(相同的分析物浓度),其中包含开发方法的预期体积。在每种情况下,都要装载样品并执行固相萃取过程。在添加不同的装载体积后,固相萃取方案继续进行,并收集提取物用于分析。回收率是根据每种情况下使用的浓度和总体积计算的。如果存在保留问题,绘图结果应显示不同化合物在加载条件下样品加载步骤中会突破和损失的点。应注意确保每个样品体积以相同的速率加载,以确保保留效率不会因加载速率而改变。
 

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